生物制藥實用技術

第一章緒論1 一、生物制藥技術突飛猛進，生物制藥產業(yè)不斷涌現1 二、癌癥研究取得新突破4 三、阿爾茨海默病、帕金森病、腦卒中及脊椎外傷研究取得新進展7 四、自身免疫性疾病有了新的治療途徑7 五、人體器官移植進展迅速8 六、預防和治療心腦血管疾病有了新手段8 七、預防和治療病毒感染有了新希望9 第二章原核細胞基因工程制藥技術11 第一節(jié)原核細胞基因工程藥物研制技術簡述11 一、基因工程藥物11 二、原核細胞基因質粒表達載體的構建15 三、基因工程菌株的構建21 四、轉化大腸桿菌（構建基因工程菌）21 第二節(jié)工程菌高密度發(fā)酵27 一、發(fā)酵罐的消毒滅菌27 二、接種培養(yǎng)發(fā)酵29 三、菌體收集29 四、菌體破碎29 第三節(jié)包含體復性33 一、包含體蛋白復性方法33 二、提高包含體蛋白的復性產率34 第三章真核細胞表達蛋白藥物研制40 第一節(jié)目的基困的獲得40 一、目的基因獲得的途徑40 二、基因擴增一—PCR技術41 第二節(jié)真核細胞常用表達載體42 一、pEGFP—N1載體的特點42 二、GFp42 三、克隆化的真核基因在哺乳動物細胞中的表達43 第二節(jié)真核細胞轉染的一般程序44 一、試劑準備44 二、操作步驟44 三、SHG—44細胞的轉染45 四、G418篩選45 第四節(jié)載體構建步驟48 一、克隆構建48 二、載體的選擇49 三、體外重組49 四、重組子的篩選49 五、克隆載體導入受體細胞52 第五節(jié)克隆載體轉染哺乳動物細胞53 一、化學轉染53 二、物理轉染54 三、重組表達質粒的細胞轉染55 第六節(jié)重組基因工程細胞的大規(guī)模培養(yǎng)59 一、重組基因工程細胞的大規(guī)模培養(yǎng)操作程序59 二、激流式生物反應器63 三、中空纖維生物反應器65 第四章基因重組蛋白的純化67 第一節(jié)目標蛋白的粗純化H67 一、離子交換色譜法67 二、疏水相互作用色譜69 三、親和色譜70 四、融合蛋白的純化72 五、反膠團萃取74 六、濁點萃取法75 七、硫酸接分級沉淀法（鹽析法）79 八、且又水相萃取技術分離純化蛋白質81 第二節(jié)目標蛋白精純化87 一、凝肢色譜87 二、雙水相高速逆流色譜法90 第二節(jié)目標蛋白大規(guī)模純化94 一、重組人血清白蛋白（rHSA）的分離提純94 二、Streamline擴張床純化重組蛋白96 第四節(jié)目標蛋白去病毒工藝101 一、離子交換色譜去除病毒工藝101 二、凝肢色譜去除病毒工藝102 三、親和色譜去除病毒工藝103 四、疏水相互作用色譜去病毒工藝103 五、去除滅活病毒的其他方法104 第五節(jié)重組蛋白冷凍干燥工藝109 一、冷凍干燥的意義109 二、蛋白質干的保護劑110 三、退火111 四、干燥 五、真空度112 六、冷凍干燥操作步驟112 第六節(jié)重組蛋白產品的穩(wěn)定性觀察113 一、觀測樣品114 二、觀測條件114 三、測定項目115 四、觀察時間116 五、運輸穩(wěn)定性研究116 六、結果的分析116 七、標示117 八、名詞解釋117 九、重組人尿激酶原穩(wěn)定性觀察117 第五章目標蛋白產晶質量檢測121 第一節(jié)目標蛋白純度和生物活性檢測121 一、目標蛋白定量測定121 二、目標蛋白產品的純度檢測126 三、目標蛋白分子質量測定129 四、目標蛋白生物活性測定131 五、目標蛋白等電點測定132 第二節(jié)重組蛋白中宿主細胞殘留物檢測135 一、目標蛋白產品中宿主細胞蛋白殘留量檢測135 二、目標蛋白產品中宿主細胞殘留DNA檢測140 一、目標蛋白產品中牛血清蛋白殘留量檢測141 四、重組目標蛋白產品中熱原值檢測143 五、重組蛋白純化工藝中可能產生的雜質檢測147 六、基因重組蛋白藥品報送國家食品藥品檢定研究院檢驗148 七、工程細胞株和細胞庫的質量控制152 第六章重組蛋白的結構分析與鑒定158 第一節(jié)重組蛋白肽圖分析158 一、重組人干擾素α1b的膚圖分析158 二、液質聯用分析重組人白細胞介素—11的肽圖159 第二節(jié)重組蛋自糖基定位和糖鏈組成分析161 一、糖鏈的釋放161 二、氣相色譜法測定重組蛋白的糖鏈組成164 第三節(jié)重組蛋白氨基酸分析165 一、目標蛋白的水解165 二、目標蛋白的氨基酸分析168 第四節(jié)重組蛋白圓二色性光譜分析和紫外光譜分析183 一、圓二色譜分析原理183 二、圓二色性尤譜實驗步驟185 三、試驗結果185 四、蛋白質紫外吸收光譜測定186 第五節(jié)重組蛋白的免疫原檢測187 一、材料與方法187 二、實驗步驟187 三、聚丙烯眈滕凝肢的配制188 四、轉膜189 五、凝肢圖像分析190 第七章重組基因工程藥物的藥效學研究191 一、動物種屬／模型的選擇191 二、給藥劑量的設置192 三、人源重組蛋白在實驗動物體內的免疫原性193 四、毒代動力學研究194 五、重組人尿激酶尿的藥效學試驗196 六、rhPro—UK對豬冠狀動腺血栓的溶栓作用198 第八章基因重組藥物的臨床前安全評價201 第一節(jié)基因重組藥物急性毒性試驗201 一、喝齒類動物單次給藥的急性毒性試驗201 二、非嗤齒類動物的急性毒性試驗（近似致死，劑量試驗）203 三、說明204 四、LD50的測定204 第二節(jié)重組蛋白藥品的長期毒性試驗206 一、實驗動物207 二、實驗動物飼養(yǎng)管理207 三、試驗方法207 四、說明209 第二節(jié)基因重組藥物的特殊毒性試驗211 一、微核試驗211 二、致突變試驗214 三、致癌試驗217 四、致畸試驗218 第四節(jié)基因重組蛋自的一般藥理學研究225 一、藥理學所用的生物材料226 二、受試藥物226 三、受試動物教226 四、給藥劑量226 五、重組人尿激酶原的一般藥理學研究226 第九章基因重組蛋白的藥物動力學研究231 第一節(jié)藥物動力學指導作用231 一、藥物動力學隔室模型232 二、藥物動力學參數232 三、藥物動力學方程234 四、藥物動力學尿藥數據法進行藥物動力學分析234 五、藥物動力學以血藥濃度法建立的藥物動力學方程235 六、靜脈滴垃和靜脈注射聯合用藥236 七、藥物動力學統(tǒng)計矩法237 第二節(jié)藥物的吸收、分布、排泄240 一、藥物的吸收240 二、藥物動力學生物利用度和藥物動力學模型判刑方法241 三、藥物的組織分布243 四、藥物的排泄243 五、藥物與血漿蛋白的結合244 六、重組人尿激酶原（rhPro—UK）的藥物動力學研究245 七、重組人尿激酶原的組織分布249 第十章基因重組生物藥物的注冊申報252 第一部分治療用生物制品252 一、注冊分類252 二、申報資料項目253 三、申報資料要求254 四、申報資料說明254 五、關于臨床試驗的說明258 六、進行Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗的程序258 七、進口治療用生物制品申報資料和要求259 第二部分預防用生物制品260 一、注冊分類260 二、申報資料項目261 三、申報資料的說明262 四、關于臨床試驗的說明264 五、進口預防用生物制品申報資料和要求265 參考文獻267 附錄1研究者手冊{以重組人尿激酶原為范本）273 一、新生物制品臨床研究申請表273 二、中國食品藥品檢定研究院274 三、重組人尿型纖溶酶原激活劑（rhPro—UK）的藥學、藥理學、毒理學、藥代動力學和藥放學的臨床前研究工作總結277 四、有關尿激酶原（Pro—UK）的國內外研究綜述286 附錄2知情同意書新生物藥晶臨床試驗知情同意書的設計規(guī)范及范例289